病原形态特征与培养特征
结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1um×0.4um～4um×0.4um。牛分枝杆菌则比较粗短。
在电子显微镜下可见菌体微细结构。结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质组成。
一、细胞壁
厚度为10～35nm，较一般细菌的细胞壁厚。含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。
功能：保护细菌的固有形态，抵抗酸碱物质及宿主细胞对细菌的破坏和杀伤。如果细胞壁有缺陷，细菌只能在高渗环境下生存，则称此类细菌为L型细菌。
二、细胞膜
细胞壁内层围绕于细胞质外的富于弹性的半透膜。主要成分是脂类（磷脂）和蛋白质。
功能：细菌与外界环境进行物质交换在细胞内一系列代谢活动中起重要作用。
三、细胞质
是带黏滞性的液体，充满了细胞膜内的整个空间。细胞浆内含有核糖体及其他多种颗粒。
功能：细胞合成蛋白质和核酸等生命活性物质的场所细菌对营养物质进行同化作用和异化作用的场所。
四、核质
由单一双股DNA组成。电镜下由极细的纤维物质所组成，与细胞质不分开，无核膜、核仁。
功能：细胞遗传的物质基础。
分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占菌体干重的60%，特别是有大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。因此生长成粗糙的畏水性菌落，而且也很难用一般染料染色；然而设法着色后，又不易盐酸酒精脱色；这种能抵抗盐酸酒精脱色的细菌被称为抗酸杆菌。革兰氏染色阳性，一般用齐—尼抗酸染色法，以5%石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。荧光染色镜下的抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。
牛分枝杆菌需氧，不运动，无芽孢或鞭毛。菌体两端有浓染的颗粒，其余部分有很多小的颗粒和小空泡，革兰氏染色弱阳性，单个或呈链排列，在生长初期有丝状、卵圆形、球状、双球状等多种形态改变，抗酸染色性亦受菌龄、营养与药物等影响而减弱或转为阴性。
有报道称，近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜。一般因制片时遭受破坏而不易看到。若在制备电镜标本固定前用明胶处理，可防止荚膜脱水收缩。在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜，荚膜对结核分枝杆菌有一定的保护作用。
结核分枝杆菌在体内外经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，异烟肼影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，均可导致其变为L型，呈颗粒状或丝状。异烟肼影响分枝菌酸的合成，可变为抗酸染色阴性。这种形态多形、染色多变，在肺内外结核感染标本中常能见到。临床结核性冷脓疡和组织标本中甚至还可见有非抗酸性革兰阳性颗粒，过去称为Much颗粒。该颗粒在体内或细胞培养中能返回为抗酸性杆菌，故亦为L型。
结核杆菌为严格的需氧菌。最适宜温度为37℃，低于30℃不生长。结核杆菌的细胞壁脂质含量很高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。在一般培养基中每分裂一代需要18到24小时，营养非常丰富的情况下也需要5小时以上。结核杆菌生长营养要求高，在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长良好。也有很多报道称固液双向土豆培养基可以培养结核分枝杆菌。生长最适pH值为：牛型结核菌5.9～6.9、人型菌7.4～8.0、禽型菌7.2。初次分离结核杆菌时，生长缓慢，接种后经3到4周长出菌落。结核杆菌的菌落、毒力及耐药性可发生变异。典型的菌落为粗糙型，干燥、坚硬，表面呈颗粒状，乳白或米黄色，形似菜花，毒力强；而变异菌株菌落则呈光滑型，毒力弱。在液体培养基内呈粗糙皱纹状菌膜生长，若在液体培养基中加入水溶性脂肪酸，例如Tween-80，可降低结核分枝杆菌表面的疏水性，使呈均匀分散生长，此有利于作药敏实验等。
初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般3～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中可能由于接触营养面大，细菌生长较为迅速。临床标本检查液体培养比固体培养的阳性率高数倍。但是，液体培养对技术要求很高，也比较容易污染。现在常用的液体培养基为7H9，固体培养基为7H10、7H11。
病原分类
分枝杆菌在分类上属于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。
分枝杆菌种类较多，可分为结核分枝杆菌复合群（MTBC包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、其DNA有85%~100%相关性，分类地位相近）、非结核分枝杆菌、和麻风分枝杆菌三类。
长期以来，分枝杆菌属的分类、鉴定一直采用以表型特征为主的方法。伯吉细菌分类鉴定系统是最具权威的且一直在沿用，对包括分枝杆菌在内的细菌分类、鉴定仍将发挥着巨大的作用。
传统分类鉴定主要依靠以下试验：①培养鉴定试验：按常规配制对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼培养基，取试验菌株菌悬液0.1ml接种，37℃培养，4周看结果。②生化试验：68℃耐热过氧化氢酶试验、硝酸还原试验和吐温80水解试验等。
但是，对新的分离菌株的分类鉴定传统方法不太可靠，需要多种信息的综合。现在大趋势是按照种系进化的关系用多相分类鉴定的方法确定精确的位置和定种。
由于分子生物学技术的引入，以PCR为基础的各种技术的发展，为分枝杆菌分类鉴定开辟了新的途径。16s rDNA、23s rDNA、16s ～23s rDNA IGS以及hsp65基因是可以选择的不同等级分类单位的核酸靶序列，尤其是16s ～23s rDNA IGS可变性高，信息量大，对分枝杆菌是最理想的分类鉴定单位。PCR-RFLP是一种快速、简便、准确的技术。
从分类学角度看，一般认为，rRNA 是研究系统进化关系的最好材料。核糖体含23s、16s、5s 三种rRNA，占细菌所有RNA的80%。因在染色体上有其互补的碱基，称为rDNA。它们含核苷酸数分别约为2900、1540、120个。5s rRNA没有足够的遗传信息用于分类学研究，23s rRNA相对分子质量较大，分析有一定困难，因此人们看中了16s rRNA。
16s rDNA：16s rDNA 相对分子质量适中，广泛应用于属和种水平种系发育分析、鉴定。16s rDNA分子中有些部位的序列在进化过程中变化非常缓慢，种间没有太大变化，即有高度保守性，可用这些序列来确定古代的进化关系，作为菌属的划分指标；还有一些部位，序列变化较大，可以用来研究亲缘关系比较接近的种属间的关系，鉴定部分菌种。16s rDNA 已应用于分枝杆菌属的划分和菌种鉴定。
16s～23s rDNA 基因间隔区（intergenic spacer，IGS）：是指位于16s rDNA基因与23s rDNA基因之间的间隔区域序列。缓慢生长分枝杆菌IGS含有一个拷贝，不编码最终产物，不含tRNA，长约280bp，一般在设计引物时，将邻近的16s rDNA与23s rDNA 部分保守性强的序列包括在内，因此，PCR扩增产物相对分子质量要大。IGS序列有高度保守的部分，但与16s 和23s rDNA 比较，有更高的变异性，表现出长度和序列结构上的多态性，IGS至少含有7个酶切位点。近几年来，已用于多种微生物种水平以下的鉴定。研究表明，IGS是一个良好的遗传标记。1996年泰国Lappayawichit等报道用16s～23s rDNA IGS序列对分枝杆菌进行较系统的分类、鉴定，证明是一个良好的鉴定单位。有的学者对鸟分枝杆菌复合体的IGS进行序列分析，其序列差异至少有12个核苷酸，将其分成12个序列亚型，以达到快速鉴定的目的。国内研究人员报道，IGS序列经PCR扩增和限制性内切酶HaeⅢ、MSPI消化反应，可将分枝杆菌与星状诺卡菌、红色球菌、北京棒状杆菌、短小棒状杆菌等不同菌属的代表种区别开；21种受试的分枝杆菌，86%可鉴定到种的水平，与9种非分枝杆菌的图谱也不同。
hsp65：hsp65基因保守性强，存在于所有分枝杆菌以及一些放线菌、白色链霉菌、大肠杆菌中。hsp65序列长度约1380bp，PCR扩增产物用限制性内切酶BSTEⅡ和HaeⅢ消化，34种分枝杆菌108株临床分离株呈现49种不同图谱。同时，在分枝杆菌中含有种特异性等位基因的变异和DNA序列的变异，用于准确、快速鉴定分枝杆菌。
病原理化特性
一、结核杆菌对外界的抵抗力很强
在土壤中可生存7个月，在粪便内可生存5个月，在牛奶中可存活90天。因结核杆菌体内含有大量类脂质，占结核菌干重的40%，细胞壁内含量最多，且其富脂外壁的疏水性，一般的消毒剂难以渗入，对外界条件有异常大的抵抗力，使通常的灭菌方法易失败，15%硫酸或15%氢氧化钠溶液处理30分钟，可杀死一般的病原菌，但不能杀死结核杆菌。在阴暗潮湿的地方可生存数月，在阳光暴晒下能生存数小时，在-7℃以下可生存4~5年。但在100℃沸水中数分钟可死亡，因此，煮沸消毒是最有效最经济的方法。醇脂性溶剂——酒精能渗入其酯层而发挥奇效，用75%酒精2分钟便可将它杀死。常用消毒药经4小时可将其杀死，70％酒精、10％漂白粉、氯胺、石炭酸、3％甲醛等均有可靠的消毒作用。
二、结核分枝杆菌不发酵糖类
牛分枝杆菌与结核分枝杆菌在培养特性上的区别点之一在于后者可合成烟酸和还原硝酸盐，而前者不能。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性；非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。热触酶试验检查方法是将浓的细菌悬液置68℃水浴加温20分钟，然后再加H2O2，观察是否产生气泡，有气泡者为阳性。
有研究者认为结核分枝杆菌对多种消毒剂如5%的石炭酸、4%的NaOH和3%的福尔马林均敏感；对湿热抵抗力弱，60℃30分钟即失去活性。但结核分枝杆菌因富含类脂和蜡脂，对外界环境的抵抗力较强，不会轻易被扑灭，3℃条件下可存活6~12个月，即使是盛夏，也能在粪便中存活2~3d。在干燥的组织液中可存活6~8个月，在冰点下能存活4~5个月，在污水中可保持活力11~15个月。因此有人对我国目前牛奶的消毒效果表示怀疑，但也有人认为巴氏消毒处理的奶制品已无危险。
三、结核分枝杆菌易发生耐药性
在固体培养基中添加常用的异烟肼、链霉素、利福平，能生长的结核分枝杆菌为耐药菌。耐药菌株活力和毒力有所减弱。异烟肼可影响细胞壁中分枝菌酸的合成，诱导结核分枝杆菌成为L型，此可能是耐异烟肼的一种原因。药物敏感试验表明对异烟肼耐药，而对利福平和链霉素大多仍敏感。故目前治疗多主张异烟肼和利福平联合用药，以减少耐药性的产生，增强疗效。临床上耐异烟肼菌株致病性也有所减弱。实验证明豚鼠感染结核分枝杆菌常于6周内死亡，且肝内见有粟粒性病灶；而感染L型后往往要百余天才死亡，病灶缺乏典型结核结节病变。但L型有回复的特性，未经彻底治疗可导致复发。
四、结核杆菌具有抗酸染色特性
结核分枝杆菌含有脂质、蛋白质和多糖体，结核蛋白质能使机体致敏，产生变态反应。结核分枝杆菌无内毒素，也不产生外毒素和侵袭性酶类，其致病作用主要靠菌体成分，特别是细胞壁所含的大量脂质。脂质含量与结核分枝杆菌的毒力呈平行关系，含量越高毒力越强。
1、脂质
据实验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质成分有关，特别是糖脂更为重要。主要包括磷脂、脂肪酸和蜡脂，它们大多与蛋白质或多糖质结合成复合物存在。
（1）索状因子是分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂。能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关。它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌中提出，则细菌丧失毒力。
（2）磷脂能促使单核细胞增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节。
（3）脂肪酸，硫酸脑苷脂和硫酸多酰基化海藻糖在结核分枝杆菌毒株细胞壁中含有，可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活。这一类糖脂能结合中性红染料，产生中性红反应，借此可鉴定结合杆菌有无毒力。
（4）蜡质D是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟发型超敏反应。
