附录1：
牛结核病防治技术规范
牛结核病是由牛型结核分枝杆菌引起的一种人兽共患的慢性传染病，我国将其列为二类动物疫病。
为了预防、控制和净化牛结核病，根据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规，特制定本规范。
1适用范围
本规范规定了牛结核病的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施、控制和净化标准。
本规范适用于中华人民共和国境内从事饲养、生产、经营牛及其产品，以及从事相关动物防疫活动的单位和个人。
2诊断
2.1流行特点
本病奶牛最易感，其次为水牛、黄牛、牦牛。人也可被感染。结核病病牛是本病的主要传染源。牛型结核分枝杆菌随鼻汁、痰液、粪便和乳汁等排出体外，健康牛可通过被污染的空气、饲料、饮水等经呼吸道、消化道等途径感染。
2.2临床特征：
潜伏期一般为3～6周，有的可长达数月或数年。
临床通常呈慢性经过，以肺结核、乳房结核和肠结核最为常见。
肺结核：以长期顽固性干咳为特征，且以清晨最为明显。患畜容易疲劳，逐渐消瘦，病情严重者可见呼吸困难。
乳房结核：一般先是乳房淋巴结肿大，继而后方乳腺区发生局限性或弥漫性硬结，硬结无热无痛，表面凹凸不平。泌乳量下降，乳汁变稀，严重时乳腺萎缩，泌乳停止。
肠结核：消瘦，持续下痢与便秘交替出现，粪便常带血或脓汁。
2.3病理变化：
在肺脏、乳房和胃肠黏膜等处形成特异性白色或黄白色结节。结节大小不一，切面干酪样坏死或钙化，有时坏死组织溶解和软化，排出后形成空洞。胸膜和肺膜可发生密集的结核结节，形如珍珠状。
2.4实验室诊断
2.4.1病原学诊断
采集病牛的病灶、痰、尿、粪便、乳及其他分泌物样品，作抹片或集菌处理（见附件）后抹片，用抗酸染色法染色镜检，并进行病原分离培养和动物接种等试验。
2.4.2免疫学试验
牛型结核分枝杆菌PPD（提纯蛋白衍生物）皮内变态反应试验（即牛提纯结核菌素皮内变态反应试验）（见GB/T 18646）。
2.5结果判定
本病依据流行病学特点、临床特征、病理变化可做出初步诊断。确诊需进一步做病原学诊断或免疫学诊断。
2.5.1分离出结核分枝杆菌（包括牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌）判为结核病牛。
2.5.2牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性的牛，判为结核病牛。
3疫情报告
3.1任何单位和个人发现疑似病牛，应当及时向当地动物防疫监督机构报告。
3.2动物防疫监督机构接到疫情报告并确认后，按《动物疫情报告管理办法》及有关规定及时上报。
4疫情处理
4.1发现疑似疫情，畜主应限制动物移动；对疑似患病动物应立即隔离。
4.2动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实，开展实验室诊断。确诊后，当地人民政府组织有关部门按下列要求处理：
4.2.1扑杀
对患病动物全部扑杀。
4.2.2隔离
对受威胁的畜群（病畜的同群畜）实施隔离，可采用圈养和固定草场放牧两种方式隔离。
隔离饲养用草场，不要靠近交通要道，居民点或人畜密集的地区。场地周围最好有自然屏障或人工栅栏。
对隔离畜群的结核病净化，按本规范5.5规定进行。
4.2.3无害化处理
病死和扑杀的病畜，要按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》进行无害化处理。
4.2.4流行病学调查及检测
开展流行病学调查和疫源追踪；对同群动物进行检测。
4.2.5消毒
对病畜和阳性畜污染的场所、用具、物品进行严格消毒。
饲养场的金属设施、设备可采取火焰、熏蒸等方式消毒；养畜场的圈舍、场地、车辆等，可选用2%烧碱等有效消毒药消毒；饲养场的饲料、垫料可采取深埋发酵处理或焚烧处理；粪便采取堆积密封发酵方式，以及其他相应的有效消毒方式。
4.2.6发生重大牛结核病疫情时，当地县级以上人民政府应按照《重大动物疫情应急条例》有关规定，采取相应的疫情扑灭措施。
5预防与控制
采取以“监测、检疫、扑杀和消毒”相结合的综合性防治措施。
5.1监测
监测对象：牛
监测比例为：种牛、奶牛100%，规模场肉牛10%，其他牛5%，疑似病牛100%。如在牛结核病净化群中（包括犊牛群）检出阳性牛时，应及时扑杀阳性牛，其他牛按假定健康群处理。
成年牛净化群每年春、秋两季用牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验各进行一次监测。初生犊牛，应于20日龄时进行第一次监测。并按规定使用和填写监测结果报告，及时上报。
5.2检疫
异地调运的动物，必须来自于非疫区，凭当地动物防疫监督机构出具的检疫合格证明调运。
动物防疫监督机构应对调运的种用、乳用、役用动物进行实验室检测。检测合格后，方可出具检疫合格证明。调入后应隔离饲养30天，经当地动物防疫监督机构检疫合格后，方可解除隔离。
5.3人员防护
饲养人员每年要定期进行健康检查。发现患有结核病的应调离岗位，及时治疗。
5.4防疫监督
结核病监测合格应为奶牛场、种畜场《动物防疫合格证》发放或审验的必备条件。动物防疫监督机构要对辖区内奶牛场、种畜场的检疫净化情况监督检查。
鲜奶收购点（站）必须凭奶牛健康证明收购鲜奶。
5.5净化措施
被确诊为结核病牛的牛群（场）为牛结核病污染群（场），应全部实施牛结核病净化。
5.5.1牛结核病净化群（场）的建立
5.5.1.1污染牛群的处理：应用牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验对该牛群进行反复监测，每次间隔3个月，发现阳性牛及时扑杀，并按照本规范4规定处理。
5.5.1.2犊牛应于20日龄时进行第一次监测，100～120日龄时，进行第二次监测。凡连续两次以上监测结果均为阴性者，可认为是牛结核病净化群。
5.5.1.3凡牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验疑似反应者，于42天后进行复检，复检结果为阳性，则按阳性牛处理；若仍呈疑似反应则间隔42天再复检一次，结果仍为可疑反应者，视同阳性牛处理。
5.5.2隔离
疑似结核病牛或牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验可疑畜须隔离复检。
5.5.3消毒
5.5.3.1临时消毒：奶牛群中检出并剔出结核病牛后，牛舍、用具及运动场所等按照4.2.5规定进行紧急处理。
5.5.3.2经常性消毒：饲养场及牛舍出入口处，应设置消毒池，内置有效消毒剂，如3%～5%来苏尔溶液或20％石灰乳等。消毒药要定期更换，以保证一定的药效。牛舍内的一切用具应定期消毒；产房每周进行一次大消毒，分娩室在临产牛生产前及分娩后各进行一次消毒。
附录2：
样品集菌方法
痰液或乳汁等样品，由于含菌量较少，如直接涂片镜检往往是阴性结果。此外，在培养或作动物试验时，常因污染杂菌生长较快，使病原结核分枝杆菌被抑制。下列几种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌，而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡，并得到浓缩。
1硫酸消化法
用4%～6％硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1：5之比例加入混合，然后置37℃作用1～2小时，经3000～4000rp/m离心30min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸消化浓缩后，在沉淀物中加入3％氢氧化钠中和，然后抹片镜检、培养和接种动物。
2氢氧化钠消化法
取氢氧化钠35～40g，钾明矾2g，溴麝香草酚蓝20mg（预先用60％酒精配制成0.4％浓度，应用时按比例加入），蒸馏水1000ml混合，即为氢氧化钠消化液。
将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1：5的比例加入氢氧化钠消化液中，混匀后，37℃作用2～3小时，然后无菌滴加5%～10％盐酸溶液进行中和，使标本的pH调到6.8左右（此时显淡黄绿色），以3000～4000rp/m离心15～20min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
在病料中加入等量的4％氢氧化钠溶液，充分振摇5～10min，然后用3000rpm离心15～20min，弃上清，加1滴酚红指示剂于沉淀物中，用2N盐酸中和至淡红色，然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
在痰液或小脓块中加入等量的1％氢氧化钠溶液，充分振摇15min，然后用3000rp/m离心30min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
对痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法：取1N（或4％）氢氧化钠水溶液50ml，0.1mol/L柠檬酸钠50ml，N－乙酰－L－半胱氨酸0.5g，混合。取痰一份，加上述溶液2份，作用24～48小时，以3000rpm离心15min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
3安替福民（Antiformin）沉淀浓缩法
溶液A：碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80mL。
溶液B：氢氧化钠15g、蒸馏水85mL。
应用时A、B两液等量混合，再用蒸馏水稀释成15%～20％后使用，该溶液须存放于棕色瓶内。
将被检样品置于试管中，加入3～4倍量的15%～20％安替福民溶液，充分摇匀后37℃作用1小时，加1－2倍量的灭菌蒸馏水，摇匀，3000～4000rp/m离心20～30min，弃上清沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
附录3：GB19489-2008
实验室生物安全通用要求
1范围
本标准规定了对不同生物安全防护级别实验室的设施、设备和安全管理的基本要求。
6.1和6.2是对生物安全实验室的基础要求，需要时，适用于更高防护水平的生物安全实验室以及动物生物安全实验室。
针对与感染动物饲养相关的实验室活动，本标准规定了对实验室内动物饲养设施和环境的基本要求。需要时，6.3和6.4适用于相应防护水平的动物生物安全实验室。
本标准适用于涉及生物因子操作的实验室。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准：
2.1气溶胶
悬浮于气体介质中的粒径一般为0.001μm～100μm的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系。
2.2事故
造成死亡、疾病、伤害、损坏以及其他损失的意外情况。
2.3气锁
具备机械送排风系统、整体消毒灭菌条件、化学喷淋（适用时）和压力可监控的气密室，其门具有互锁功能，不能同时处于开启状态。
2.4生物因子
微生物和生物活性物质。
2.5生物安全柜
具备气流控制及高效空气过滤装置的操作柜，可有效降低实验过程中产生的有害气溶胶对操作者和环境的危害。
2.6缓冲间
设置在被污染概率不同的实验室区域间的密闭室，需要时，设置机械通风系统，其门具有互锁功能，不能同时处于开启状态。
2.7定向气流
特指从污染概率小区域流向污染概率大区域的受控制的气流。
2.8危险
可能导致死亡、伤害或疾病、财产损失、工作环境破坏或这些情况组合的根源或状态。
2.9危险识别
识别存在的危险并确定其特性的过程。
2.10高效空气过滤器（HEPA 过滤器）
通常以0.3μm 微粒为测试物，在规定的条件下滤除效率高于99.97%的空气过滤器。
2.11事件
导致或可能导致事故的情况。
2.12实验室
涉及生物因子操作的实验室。
2.13实验室生物安全
实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相关法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。
2.14实验室防护区
实验室的物理分区，该区域内生物风险相对较大，需对实验室的平面设计、围护结构的密闭性、气流，以及人员进入、个体防护等进行控制的区域。
2.15材料安全数据单
详细提供某材料的危险性和使用注意事项等信息的技术通报。
2.16个体防护装备
防止人员个体受到生物性、化学性或物理性等危险因子伤害的器材和用品。
2.17风险
危险发生的概率及其后果严重性的综合。
2.18风险评估
评估风险大小以及确定是否可接受的全过程。
2.19风险控制
为降低风险而采取的综合措施。
3风险评估及风险控制
3.1实验室应建立并维持风险评估和风险控制程序，以持续进行危险识别、风险评估和实施必要的控制措施。实验室需要考虑的内容包括：
3.1.1当实验室活动涉及致病性生物因子时，实验室应进行生物风险评估。风险评估应考虑（但不限于）下列内容：
a）生物因子已知或未知的特性，如生物因子的种类、来源、传染性、传播途径、易感性、潜伏期、剂量-效应（反应）关系、致病性（包括急性与远期效应）、变异性、在环境中的稳定性、与其他生物和环境的交互作用、相关实验数据、流行病学资料、预防和治疗方案等；
b）适用时，实验室本身或相关实验室已发生的事故分析；
c）实验室常规活动和非常规活动过程中的风险（不限于生物因素），包括所有进入工作场所的人员和可能涉及的人员（如：合同方人员）的活动；
d）设施、设备等相关的风险；
e）适用时，实验动物相关的风险；
f）人员相关的风险，如身体状况、能力、可能影响工作的压力等；
