10.1离子色谱法
10.1.1原理
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。
10.1.2试剂和材料
（1）超纯水：电阻率＞18.2 MΩ·cm。
（2）乙酸（CH3COOH）：分析纯。
（3）氢氧化钾（KOH）：分析纯。
（4）乙酸溶液（3 %）：量取乙酸（2.2）3 mL于100 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。
（5）亚硝酸根离子（NO-2）标准溶液（100 mg/L，水基体）。
（6）硝酸根离子（NO-3）标准溶液（1000 mg/L，水基体）。
（7）亚硝酸盐（以NO-2计，下同）和硝酸盐（以NO-3计，下同）混合标准使用液：准确移取亚硝酸根离子（NO-2）和硝酸根离子（NO-3）的标准溶液各1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，此溶液每1 L含亚硝酸根离子1.0 mg和硝酸根离子10.0 mg。
10.1.3仪器和设备
（1）离子色谱仪：包括电导检测器，配有抑制器，高容量阴离子交换柱，50 μL定量环。
（2）食物粉碎机。
（3）超声波清洗器。
（4）天平：感量为0.1 mg和1 mg。
（5）离心机：转速≥10000转/分钟，配5 mL或10 mL离心管。
（6）0.22 μm水性滤膜针头滤器。
（7）净化柱：包括C18 柱、Ag柱和Na柱或等效柱。
（8）注射器：1.0 mL和2.5 mL。
注：所有玻璃器皿使用前均需依次用2 mol/L 氢氧化钾和水分别浸泡4 h，然后用水冲洗3～5次，晾干备用。
10.1.4分析步骤
10.1.4.1试样预处理
（1）新鲜蔬菜、水果：将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆备用。如需加水应记录加水量。
（2）肉类、蛋、水产及其制品：用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。
（3）乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪)：将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。
（4）发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品：通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。
（5）干酪：取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。
10.1.4.2提取
（1）水果、蔬菜、鱼类、肉类、蛋类及其制品等：称取试样匀浆5 g（精确至0.01 g，可适当调整试样的取样量，以下相同），以80 mL水洗入100 mL容量瓶中，超声提取30 min，每隔5 min振摇一次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10 000 转/分钟离心15 min，上清液备用。
（2）腌鱼类、腌肉类及其他腌制品：称取试样匀浆2 g（精确至0.01 g），以80 mL水洗入100 mL容量瓶中，超声提取30 min，每5 min振摇一次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10 000转/分钟离心15 min，上清液备用。
（3）乳：称取试样10 g（精确至0.01 g），置于100 mL容量瓶中，加水80 mL，摇匀，超声30 min，加入3 %乙酸溶液2 mL，于4 ℃放置20 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。
（4）乳粉：称取试样2.5 g（精确至0.01 g），置于100 mL容量瓶中，加水80 mL，摇匀，超声30 min，加入3%乙酸溶液2 mL，于4℃放置20 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。
（5）取上述备用的上清液约15 mL，通过0.22 μm 水性滤膜针头滤器、C18 柱，弃去前面3 mL（如果氯离子大于100 mg/L，则需要依次通过针头滤器、C18 柱、Ag 柱和Na 柱，弃去前面7 mL），收集后面洗脱液待测。固相萃取柱使用前需进行活化，如使用OnGuard II RP柱（1.0 mL）、OnGuard II Ag 柱（1.0 mL）和OnGuard II Na 柱（1.0 mL）［给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。］，其活化过程为：OnGuard II RP 柱（1.0 mL）使用前依次用10 mL 甲醇、15 mL水通过，静置活化30 min。OnGuard II Ag 柱（1.0 mL）和OnGuard II Na 柱（1.0 mL）用10 mL水通过，静置活化30 min。
10.1.4.3参考色谱条件
（1）色谱柱：氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换柱，如Dionex IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm（带IonPac AG11-HC 型保护柱4 mm×50 mm）［给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。］，或性能相当的离子色谱柱。
（2）淋洗液：
①一般试样：氢氧化钾溶液，浓度为6～70 mmol/L；洗脱梯度为6 mmol/L 30 min，70mmol/L 5 min，6 mmol/L 5 min； 流速 1.0 mL/min。
②粉状婴幼儿配方食品：氢氧化钾溶液，浓度为5～50 mmol/L；洗脱梯度为5 mmol/L 33 min，50 mmol/L 5min，5 mmol/L 5 min；流速1.3 mL/min。
（3）抑制器：连续自动再生膜阴离子抑制器或等效抑制装置。
（4）检测器：电导检测器，检测池温度为35℃。
（5）进样体积：50 μL（可根据试样中被测离子含量进行调整）。
10.1.4.4测定
10.1.4.4.1标准曲线
移取亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液，加水稀释，制成系列标准溶液，含亚硝酸根离子浓度为0.00 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.06 mg/L、0.08 mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L；硝酸根离子浓度为0.0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L的混合标准溶液，从低到高浓度依次进样。得到上述各浓度标准溶液的色谱图（图10-1）。以亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度（mg/L）为横坐标，以峰高（μS）或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算线性回归方程。
10.1.4.4.2样品测定
分别吸取空白和试样溶液50 μL，在相同工作条件下，依次注入离子色谱仪中，记录色谱图。根据保留时间定性，分别测量空白和样品的峰高（μS）或峰面积。
10.1.5分析结果的表述
试样中亚硝酸盐（以NO-2计）或硝酸盐（以NO-3计）含量按式（10-1）计算：
X=(c-c0)×V×f×1000m×1000（10-1）
式中：X——试样中亚硝酸根离子或硝酸根离子的含量，mg/kg；
c——测定用试样溶液中的亚硝酸根离子或硝酸根离子浓度，mg/L；
c0——试剂空白液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度，mg/L；
V——试样溶液体积，mL；
f——试样溶液稀释倍数；
m——试样取样量，g。
说明：试样中测得的亚硝酸根离子含量乘以换算系数1.5，即得亚硝酸盐（按亚硝酸钠计）含量；试样中测得的硝酸根离子含量乘以换算系数1.37，即得硝酸盐（按硝酸钠计）含量。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。
10.1.6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值差不得超过算术平均值的10%。
10.2分光光度法
10.2.1原理
亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。
10.2.2试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682 规定的二级水或去离子水。
（1）亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O）。
（2）乙酸锌（Zn(CH3COO)2·2H2O）。
（3）冰醋酸（CH3COOH）。
（4）硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）。
（5）盐酸（ρ＝1.19 g/mL）。
（6）氨水（25 %）。
（7）对氨基苯磺酸(C6H7NO3S）。
（8）盐酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）。
（9）亚硝酸钠（NaNO2）。
（10）硝酸钠（NaNO3）。
（11）锌皮或锌棒。
（12）硫酸镉。
（13）亚铁氰化钾溶液(106 g/L)：称取106.0 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000 mL。
（14）乙酸锌溶液(220 g/L)： 称取220.0 g乙酸锌，先加30 mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000 mL。
（15）饱和硼砂溶液(50 g/L)： 称取5.0 g硼酸钠，溶于100 mL热水中，冷却后备用。
（16）氨缓冲溶液（pH 8.6～8.7）：量取30 mL盐酸，加100 mL水，混匀后加65 mL氨水，再加水稀释至1 000 mL，混匀。调节pH至8.6～8.7。
（17）氨缓冲液的稀释液：量取50 mL氨缓冲溶液，加水稀释至500 mL，混匀。
（18）盐酸(0.1 mol/L)： 量取5 mL盐酸，用水稀释至600 mL。
（19）对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶于100 mL 20 %（V/V）盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。
（20）盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：称取0.2 g 盐酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存。
（21）亚硝酸钠标准溶液（200 μg /mL）：准确称取0.1000 g于110～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入 500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
（22）亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00 mL，置于200 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
（23）硝酸钠标准溶液（200 μg/mL，以亚硝酸钠计）：准确称取0.123 2 g于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于入 500 mL 容量瓶中，并稀释至刻度。
（24）硝酸钠标准使用液（5 μg/mL）：临用时吸取硝酸钠标准溶液2.50 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
10.2.3仪器和设备
（1）天平：感量为0.1 mg 和1 mg。
（2）组织捣碎机。
（3）超声波清洗器。
（4）恒温干燥箱。
（5）分光光度计。
（6）镉柱：
①海绵状镉的制备：投入足够的锌皮或锌棒于 500 mL硫酸镉溶液(200 g/L)中，经过3～4 h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤，然后移入组织捣碎机中，加500 mL水，捣碎约2 s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20～40目之间的部分。
②镉柱的装填：如图10-2。用水装满镉柱玻璃管，并装入2 cm高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下加入海绵状镉至8～10 cm高，上面用1 cm高的玻璃棉覆盖，上置一储液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。如无上述镉柱玻璃管时，可以25 mL酸式滴定管代用，但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。当镉柱填装好后，先用25 mL盐酸(0.1 mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25 mL，镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。
③镉柱每次使用完毕后，应先以25 mL盐酸（0.1 mol/L）洗涤，再以水洗两次，每次25 mL，最后用水覆盖镉柱。
④镉柱还原效率的测定：吸取20 mL 硝酸钠标准使用液，加入5 mL氨缓冲液的稀释液，混匀后注入储液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当储液漏斗中的样液流完后，再加5 mL水置换柱内留存的样液。取9.0 mL 还原后的溶液（相当10 μg 亚硝酸钠）于50 mL比色管中，以下按10.2.4.4自“吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80mL、1.00mL……”起依法操作，根据标准曲线计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于98%为符合要求。
