在符合《实验室生物安全通用要求》及《病原微生物实验室生物安全管理条例》的要求及条件的基础上，在开展牛结核分枝杆菌相关的实验室操作时，应对操作目的、工作人员的要求与职责、操作程序有明确、严格的规定。各生物安全实验室应根据实际情况制定相应的操作规范，确保实验室工作的顺利开展。由于牛结核分枝杆菌的特殊性，所以规定相关的操作均应在国家认定的生物安全三级（P3）实验室进行，以下所涉及到的要求与注意事项均在此基础上提出。
牛结核分枝杆菌培养技术要求
1.目的
明确牛结核分枝杆菌培养试验的标准化、规范化操作。
2.适用范围
所有操作牛结核分枝杆菌的实验人员。
3.职责
操作牛结核分枝杆菌的实验人员必须取得ABSL-3实验室准入的资质证明，有责任保护环境和他人的生命安全，有义务接受生物安全管理委员会和室主任的监督。
4.场所
牛结核分枝杆菌的样品接收和处理，所有的加液、移液、洗涤、离心管盖拧开与拧紧都应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。
采用防气溶胶密闭式水平离心机离心，在生物安全柜时任何物体表面都应保持不受污染，若有污染应用3％石炭酸或其他可靠消毒液表面消毒处理。
所有的废弃标本、污染物（包括洗涤液）均应收集于含消毒液，并套有耐高温高压塑料袋的容器中。实验完毕后将塑料袋口扎紧连同容器一起一并进行高温消毒。
5.程序
进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。查看前一位实验者是否已经清场，是否有记录。确认实验区已消毒后，带入已消毒物品，登记，进入实验区。
1.培养基的制备
（1）土路豆（Trudeau）培养基。
成分：
马铃薯甘油浸液330ml
卵黄300ml
卵白30ml
1%孔雀绿水溶液13ml
制法：
①将马铃薯洗净去皮，称取100g，绞碎后加入8%甘油水溶液500ml，置高压蒸汽15磅30分钟，取出后滤出其上层马铃薯甘油浸出液330ml供用。
②用肥皂洗净鸡蛋外壳，浸泡于75%酒精中30分钟，取出用无菌镊子打开蛋壳，将蛋黄和蛋白分开，分盛于无菌玻璃瓶内，振荡摇匀。取蛋黄300ml与蛋白30ml，加于上述马铃薯甘油浸液330ml内。
③摇匀，再加入1%孔雀绿水溶液13ml，再行混合，用无菌纱布过滤，分装于标准螺旋盖培养管或灭菌中试管中，每管7ml，加热使凝固成斜面。用间歇灭菌法灭菌。培养基斜面应占试管的2/3。
④制成的培养基斜面应表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。
⑤制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。
（2）改良罗氏培养基。
成分：
谷氨酸钠（纯度99%以上）7.2g
磷酸二氢钾（KH2PO4）14.0g
硫酸镁（MgSO47H2O）0.24g
柠檬酸镁0.6g
丙三醇12ml
马铃薯淀粉30g
蒸馏水600ml
新鲜全卵液1000ml
2%孔雀绿水溶液20ml
制法：
①基础液制备：量取蒸馏水600ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和丙三醇，溶解后加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴1小时使呈糊状（不时摇动，防凝块），冷却。
②新鲜鸡卵液制备：洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20～30分钟。取出，擦干，开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液。
③将600ml基础液和1000ml新鲜鸡卵液混匀。加入2%孔雀绿水溶液20ml，混匀，静置1小时后，分装至标准螺旋盖培养管或灭菌中试管中，每管7ml。用间歇灭菌法灭菌。培养基斜面应占试管的2/3。
④制成的培养基斜面应表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。
⑤制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。
（3）其他商品化培养基。
①按商品说明，溶解、分装、灭菌、制备成固体斜面培养基，4℃避光保存备用。
②也可按说明溶解、灭菌、制备成液体培养基，4℃避光保存备用。
2.样本接种前去污染处理
（1）痰标本：视样本性，通常取2～4ml，盛于离心管中，加入1～2倍体积4%氢氧化钠（NaOH）消化液，拧紧离心管盖，摇振5～10分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15～20分钟。然后滴加5%～10%盐酸液中和，使混悬液变为淡黄绿色为止（pH值约6.8）。最后以1600~1800r/min 离心20-30分钟，取沉淀物用作镜检和分离培养及动物接种。样本数较多时，应分批处理。
（2）其他样本：尿液、胃或支气管灌洗液等可能污染样本可参照痰样本处理方法。血液、脑脊液、纯培养物等无污染样本，无需作去污染处理。
3.接种和培养
（1）接种操作应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。固体斜面培养基常用于临床标本细菌的分离培养、菌种保存、药物敏感试验等，液体培养基用于纯培养物增菌、药物敏感试验及其他特殊用途。
（2）用吸管取去污染后的标本0.1ml，均匀接种在整个培养基斜面，临床标本每份应接种2支斜面培养基，纯培养物转种视实验要求而定。
（3）接种后斜面向上，于37℃环境中平放24小时后，检查培养基污染情况，然后直立放置，37℃继续培养。
4.结果观察
（1）对于固体斜面培养基，于接种后第3、第7天各观察一次菌落生长情况。发现菌落生长者，临床标本培养时经抗酸染色证实后，可视快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察一次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可视分枝杆菌生长。满8周后未见菌落生长者视培养阴性。分离培养出的分枝杆菌需进一步作菌种鉴定。
（2）观察时发现非分枝杆菌生长时，应视为其他细菌污染。临床标本培养污染率应在2%～5%范围内。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。
5.清场
填写实验室和仪器使用记录和清场记录，内容如下：
清场记录（是划√，否划×。）
（1）是否将带毒物品进行消毒处理。（）
（2）生物安全柜是否填写使用记录。（）
（3）生物安全柜用后是否消毒。（）
（4）恒温培养箱是否填写温度记录。（）
（5）实验室其他仪器工作状态和是否填写使用记录。（）
（6）实验废弃物是否消毒处理。（）
6.可能危害
结核病牛胸水、脑脊液、支气管灌洗液淋巴细胞，在进行样品处理过程中可能污染有结核病菌；样品称重时，如直接在天平上称量，会污染天平，造成感染性物质在实验室内的扩散；在无菌研钵中用研槌研磨，制备成悬液。如操作不慎，易发生悬液外溢，导致病料污染实验台面；弃去的拭子、使用过的研钵如果不及时放入消毒袋中经高压处理或没有及时放入消毒液中浸泡再高压处理，也易污染实验台面；在研磨和捣碎的操作中均可产生气溶胶，如不加以适当防护，易增加吸入感染的可能性；样品在离心过程中，如离心管有裂纹，未加以仔细检查，离心时不平衡造成离心管破裂等，样品将从离心管中溢出，污染离心机，不及时认真处理。在上述情况下，易发生病料泄漏，造成实验室环境污染和实验人员感染。
7.应急措施
在进行样品处理过程中，为避免气溶胶的产生和病原体扩散并感染实验操作人员，所有操作应在生物安全柜中进行，实验人员着三级个人防护用品；样品必须在密封的容器内称重；样品在无菌研钵中用研槌研磨时，应小心操作，在预先铺好的消毒纸巾上研磨，一旦发生外溢，及时用消毒纸巾擦拭消毒；弃去的拭子、使用过的研钵及时放入消毒袋中经高压处理或没有及时放入消毒液中浸泡再高压处理；如发生标本收集管破裂，应停止实验，先用一块布或纸巾盖上，再把消毒剂倒到上面，至少静置30分钟，然后才可把布和纸巾及打碎的物品清理走。玻璃碎片应用镊子夹取，污染区应用消毒剂拖干净。如离心过程中发生收集管破裂应关闭电源并且保持离心机盖子关闭30分钟。如果在机器停止运行后发生了破裂，离心机盖应立即关闭并保持30分钟，并及时通知实验室生物安全员。
牛结核分枝杆菌抗酸染色法技术要求
1.目的
明确牛结核分枝杆菌抗酸染色法试验的标准化操作。
2.适用范围
所有操作牛结核分枝杆菌的实验人员。
3.职责
操作牛结核分枝杆菌的实验人员必须取得ABSL-3实验室准入的资质证明，有责任保护环境和他人的生命安全，有义务接受生物安全管理委员会和室主任的监督。
4.场所
牛结核分枝杆菌的样品接收和处理，所有的加液、移液、洗涤、离心管盖拧开与拧紧都应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。
采用防气溶胶密闭式水平离心机离心，在生物安全柜时任何物体表面都应保持不受污染，若有污染应用3％石炭酸或其他可靠消毒液表面消毒处理。
所有的废弃标本、污染物（包括洗涤液）均应收集于含消毒液，并套有耐高温高压塑料袋的容器中。实验完毕后将塑料袋口扎紧连同容器一起一并进行高温消毒。
5.程序
实验人员在进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。查看前一位实验者是否已经清场，是否有记录。确认实验区已消毒后，带入已消毒物品，登记，进入实验区。
1.涂片的制备
此步骤应在生物安全三级实验室生物安全柜内完成。
（1）涂片：各种标本约涂成直径1.5cm×l.5cm大小为宜。一张载玻片只可涂抹一份标本。载玻片经95%乙醇擦拭脱脂，干燥、清洁、无油污、无划痕，涂片前于玻片背面的左端1/3处用油性标记笔编号。玻片最好只使用一次。
（2）痰标本涂片制备：
①直接涂片法。用接种环或专用竹签挑取标本的脓样、干酪样部分约0.05～0.1ml，于载玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成椭圆形痰膜。
②集菌涂片法。
漂浮集菌法：取深咳痰或12～24小时痰液经121.3℃高压灭菌15分钟，待冷后，取0.5～1ml盛于体积为10ml的玻璃容器中（口径约2cm），加灭菌蒸馏水2ml，总体积勿超过容器的1/3，加二甲苯0.03ml，放振荡器振荡10分钟，取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载玻片盖于瓶口上，静置20分钟，取下载玻片。
离心集菌法：取深咳痰或12～24小时痰液经121.3℃高压灭菌15分钟，待冷后，取0.5～1ml盛于体积为50ml的离心管中，加水至5ml，经6000～8000rpm离心20分钟后，小心蘸取离心沉渣少许作涂片。
（3）其他标本涂片制备：脑脊液、尿液、胃或支气管灌洗液等标本涂片制备。各种标本先以6000～8000rpm离心20分钟后小心蘸取离心沉渣少许作涂片。
细菌纯培养物涂片制备。将细菌液体培养物直接涂布于载玻片；或先在载玻片上放置一接种环生理盐水，再取细菌固体培养物与生理盐水磨匀，取菌量不可太多，使盐水磨成灰白色即可。
2.干燥
涂片最好在室温下自然干燥。
3.固定
干燥后的标本片以涂有标本的一面朝上，迅速通过火焰3次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉。
4.染色方法
（1）齐-尼氏染色法：将涂片平放于染色缸上方的支架上（注意要放平以免染色液倾泻），滴加石炭酸复红液，须加稍多量以淹没涂布区，染色5分钟后用水冲洗。以3%盐酸酒精充分脱色，随即用水冲洗。再用吕氏美兰染1分钟，用水冲洗，待干，在油镜下检查。
（2）结核病牛痰抗酸染色——厚片法：本法特点是制作涂片时较普通涂片厚3~4倍，染色时，用亚硫酸钠溶液代替美蓝，染3~5分钟，其余方法与一般抗酸法相同。本法优点为检出阳性率高。
5.结果观察
用普通光学显微镜油镜观察。
（1）油镜的识别：油镜头上都有标记；标有100×；镜头前端有黑、白或红色的圆圈；刻有“III”或Oil等，其入光孔径也较其他物镜小。
（2）油镜的使用（观察细菌的形态）：将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。以天然光线为光源时，使用平面反光镜；以灯光为光源时，使用凹面反光镜。把集光器升到最高位置，把光圈完全打开，增大射入光线的强度。接着将标本固定在载物台上，先把低倍镜调至视野最亮，并找到标本视野的适当位置，然后换用油镜。先在玻片上滴香柏油1滴，用眼从侧方看着物镜，缓慢转动粗调节器，使物镜头浸于油镜内，并几乎与玻片接触为止，但勿使两者相碰，防止损伤镜头或玻片。然后从目镜视察，仔细转动粗调节器，看到模糊物像时，再调动细调节器，使物像清晰，未能看到物像时，可重复上述操作。
（3）染色结果：牛结核分枝杆菌为抗酸菌，被染成红色；非抗酸菌及其他组织细胞被染成蓝色。
