六、废弃标本、污染物及操作工作面的处理
痰瓶（盒）、废弃标本、培养物等污染物，均需经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。将痰瓶（盒）等标本置于一搪瓷盘中，在生物安全柜内进行涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物等置于含消毒液并套有耐高温高压塑料袋的容器中，一并进行高压蒸汽灭菌。
标本操作工作面的消毒：生物安全柜操作面以3％石炭酸或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线照射30分钟。
七、清场
填写实验室和仪器使用记录和清场记录，内容如下：
清场记录（是划√，否划×。）
（1）是否将带毒物品进行消毒处理。（）
（2）生物安全柜是否填写使用记录。（）
（3）生物安全柜用后是否消毒。（）
（4）恒温培养箱是否填写温度记录。（）
（5）实验室其他仪器工作状态和是否填写使用记录。（）
（6）实验废弃物是否消毒处理。（）
八、各种抗酸染色液的配制
1.石炭酸复红液
碱性复红酒精饱和溶液10ml、6%石炭酸90ml
2.3%盐酸酒精
浓盐酸3ml、95%酒精97ml
3.吕氏美兰液
美蓝酒精饱和溶液30ml、氢氧化钾（1：10000）100ml
4.亚硫酸钠溶液配制：
5%无水亚硫酸钠400ml、95%酒精100ml
九、应急措施
在样品接种、研磨的过程中，有污染实验台面的风险；涂布载玻片的操作有产生气溶胶的可能。在进行样品处理过程中，为避免气溶胶的产生和病原体扩散并感染实验操作人员，所有操作应在生物安全柜中进行，实验人员着三级个人防护用品。样品应放置在预先铺好的消毒纸巾上，一旦样品悬液滴落在实验台面上，应及时用消毒液进行处理。小心吸取和稀释样品悬液，尽量减少气溶胶的产生；另外，实验产生的废弃物应收集在盛有消毒液的容器内，防止废弃物对实验室环境的污染。
牛结核分枝杆菌菌种鉴定试验技术要求
1.目的
明确牛结核分枝杆菌菌种鉴定试验的标准化操作。
2.适用范围
所有操作牛结核分枝杆菌的实验人员。
3.职责
操作牛结核分枝杆菌的实验人员必须取得ABSL-3实验室准入的资质证明，有责任保护环境和他人的生命安全，有义务接受生物安全管理委员会和室主任的监督。
4.场所
牛结核分枝杆菌的样品接收和处理，所有的加液、移液、洗涤、离心管盖拧开与拧紧都应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。
采用防气溶胶密闭式水平离心机离心，在生物安全柜时任何物体表面都应保持不受污染，若有污染应用3％石炭酸或其他可靠消毒液表面消毒处理。
所有的废弃标本、污染物（包括洗涤液）均应收集于含消毒液，并套有耐高温高压塑料袋的容器中。实验完毕后将塑料袋口扎紧连同容器一起一并进行高温消毒。
5.程序
1.增菌传代
经抗酸染色镜检确定是抗酸菌的培养阳性菌株，必须首先接种改良罗氏（L-J）培养基进行增菌传代。
2.生化试验
进行分枝杆菌菌种鉴定，首先经对硝基苯甲酸（PNB）生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色，确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌（NunTuberculosis Mycobacterium，NTM）。鉴定试验确定属于结核分枝杆菌复合群的菌株，需进行TCH生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验进行菌种鉴定。
属于NTM的菌株，首先根据生长速度的快慢确定属于快速生长还是缓慢生长的分枝杆菌。快速生长的分枝杆菌可通过生长特征和生化实验进行菌种鉴定；缓慢生长的分枝杆菌经色素产生试验确定菌株的产色特征后，再通过生长特征和生化试验确定菌株的种类。
3.分枝杆菌菌群鉴定试验
（1）分枝杆菌菌群鉴定的目的既是鉴定菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM，也是进行进一步菌种鉴定的基础。
（2）分枝杆菌菌群主要通过菌株在含对硝基苯甲酸（PNB）的鉴别培养基上的生长情况、28℃生长情况、生长速度、耐热触酶试验及观察菌株的菌落形态、颜色等生物特征来进行区分。通过上述试验，可将需要鉴定的菌株划归结核分枝杆菌复合群或NTM菌群。
4.牛结核分枝杆菌复合群菌种鉴定试验
目前，临床分离鉴定属于牛结核分枝杆菌菌群的菌株，牛结核分枝杆菌和牛分枝杆菌占绝大多数。这两种分枝杆菌，需要同时采用下列实验进行鉴别区分：噻吩－2－羧酸肼（TCH）培养基生长、硝酸还原试验、烟酸试验。
5.NTM菌群生长特征鉴定试验
经菌群鉴定试验被划归为NTM菌群的分枝杆菌，如需进一步进行菌种鉴定，应首先进行生长特征鉴定试验。相关试验主要目的是观察分枝杆菌的生长速度、色素产生情况、菌落形态特征、在各种鉴别培养基上生长情况的结果，包括：苦味酸培养基生长试验、5%NaCl培养基生长试验、谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基生长试验、麦康凯琼脂培养基生长试验等。
6.NTM菌种鉴定常用生化特征试验
经菌群鉴定试验被划归为NTM菌群的分枝杆菌，在进行生长特征鉴定试验的同时，还应进行常用的生长特征鉴定试验，以进一步鉴定到种水平。相关的试验包括：Tween-80水解试验、尿素酶试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚碲酸盐还原试验等。
六、菌种鉴定试验的安全防护和质量控制
进行相应实验时，涉及暴露细菌的操作均应在三级生物安全实验室内生物安全柜内进行，还应采取其他必要防护措施，注意防止菌株对操作人员、实验室和社会环境造成危害和污染。所有进行菌种（菌群）鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为3～4周，且生长良好；所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限；所有标明有对照的鉴别实验，在实施时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。
牛结核分枝杆菌的动物接种试验技术要求
一、目的
明确牛结核分枝杆菌动物接种试验的标准化操作。
二、适用范围
所有操作牛结核分枝杆菌的实验人员。
三、职责
操作牛结核分枝杆菌的实验人员必须取得ABSL-3实验室准入的资质证明，有责任保护环境和他人的生命安全，有义务接受生物安全管理委员会和室主任的监督。
四、场所
牛结核分枝杆菌的样品接收和处理，所有的加液、移液、洗涤、离心管盖拧开与拧紧都应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。
采用防气溶胶密闭式水平离心机离心，在生物安全柜时任何物体表面都应保持不受污染，若有污染应用3％石炭酸或其他可靠消毒液表面消毒处理。
所有的废弃标本、污染物（包括洗涤液）均应收集于含消毒液，并套有耐高温高压塑料袋的容器中。实验完毕后将塑料袋口扎紧连同容器一起一并进行高温消毒。
五、程序
1.实验动物的准备
实验动物的准备、麻醉、解剖和尸体处理等参见《动物实验安全手册》。接种样品的准备参见第一节“牛结核分枝杆菌的培养试验”样品处理部分。样本接种前去污染处理
