PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。③引物的延伸：DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性－退火－延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
2.标准的PCR反应体系
PCR反应五要素，参加PCR反应的物质主要有五种，即引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
3.PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的基本原则
（1）引物长度：15～30bp，常用为20bp左右。
（2）引物碱基：G+C含量以40～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3）引物内部不应出现互补序列。
（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补序列重叠。
（5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
（6）引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
（7）引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其他短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
4.模板的制备
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
5.PCR反应条件的控制
（1）PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。
（2）镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L 。
（3）底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L。
（4）Taq DNA聚合酶2.5U（100ul）。
（5）引物浓度一般为0.1～0.5umol/L。
（6）反应温度和循环次数PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
变性温度和时间95℃，30秒
退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃
延伸温度和时间72℃，1分钟/kb（10kb内）
Tm值=4（G+C）＋2（A+T）
循环次数：一般为25～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
2.PCR在检测疑似结核杆菌样品中的应用
PCR方法测定培养分离物或可疑动物组织样品中的牛分枝杆菌DNA。很多商业化的试剂盒和各种自己新研制的方法已用于结核杆菌病复合体的检测。各种各样的引物也已广泛应用，包括16sRNA、16s rDNA的扩增序列，IS6100和IS1081的插入序列，以及编码结核杆菌复合体特异性蛋白基因，比如MPB64和38Kda抗原。已经用核酸探针杂交或凝胶电泳方法分析了扩增产品。商品化试剂盒和各科研部门研制的方法检测结果差异较大，而且很难获得满意的结果。假阳性和假阴性结果，尤其是含有少量细菌的样品降低了试验结果的可靠性。由于去除污染的方法、DNA提取步骤、去除多聚酶抑制剂技术、内部和外部控制以及交叉污染的防止措施等差异常使得结果千差万别。PCR作为一种检测临床样品结核杆菌复合物的改善的方法需要标准化，并且要求更严格的步骤。该法已经用于福尔马林固定、石蜡包埋的组织以检测结核杆菌群和区分禽结核杆菌。
DNA分析技术与区分牛结核杆菌和其他结核杆菌复合体的生化方法相比更加快速、可靠。到目前为止，已经发现oxyR基因285核苷酸突变在所有结核杆菌复合体中对牛结核杆菌是特异性的，用于杂交、监测扩增片段的特异基因探针可以用生物素或地高锌标记而不用同位素是非常重要的。
四、DNA指纹图谱分析
基因指纹图谱分析可以区分不同株的牛结核杆菌，而且能够定型上述原发的、传染的和散播的牛结核杆菌。这种方法允许不同菌株插入属于结核杆菌复合体，包括牛结核杆菌的各个种中，并且能区分牛结核杆菌和其他结核杆菌。其他新的检测技术仍在研究中，目的是更加精确的区分具有同样spoligotype的菌株。这些方法包括用PGRS探针（多聚G重复序列）的限制性片段长度多态性分析（RFLP）、以VNTR剖面（多种纵列重复）为特征的扩增片段长度多态性分析（AFLP）。PCR-RFLP菌种鉴定法是以分枝杆菌属特异性引物对标本中分枝杆菌6Sku蛋白编码基因、16S或16～23SrDNA进行扩增，然后用不同的限制性内切酶消化扩增片段，通过电泳分析酶切图谱来鉴定菌种。目前只能鉴定部分菌种，重复性还不够理想。下面简单介绍一下。
1.图谱分析原理
从生物样品中提取DNA（DNA 一般都有部分的降解），可运用PCR 技术扩增出高可变位点或者完整的基因组DNA ，然后将扩增出的DNA 酶切成DNA 片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的DNA 探针与膜上具有互补碱基序列的DNA 片段杂交，用放射自显影便可获得DNA图谱。
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp 至近50kb 的DNA 。长度100kb 或更大的DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受分子大小、构象、电场强度和方向、碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。
2.实验步骤
（1）DNA 样品的制备：采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37℃孵化数小时，消化蛋白质分离DNA ；使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA ；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀DNA 。
由于一般采集的样本中的DNA 都有不同程度的降解，采用PCR 技术扩增出完整的基因组DNA 或者特定的高可变位点，以此制备出的DNA 样品备用。
（2）DNA 样品的酶切反应：设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样。
（3）酶切产物的琼脂糖电泳：
①在100ml电泳缓冲液（1TAE或0.5TBE）中加入1g琼脂糖，加热熔化，注意观察，当心煮沸的液体溢出。当凝胶冷却至60℃左右时加入5ul溴化乙锭溶液（终浓度为1ug/ml），充分混匀。
②先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒入凝胶（凝胶厚度在5mm左右）。
③在凝胶完全凝固后（室温放置30～45分钟），小心移去梳子和透明胶带，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（液面超过胶带2～3mm）。
④取已制备好的酶切DNA样品，加入1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物，对照以及酶切DNA样品各5～10ml。
⑤盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用50～100伏），电泳40～60分钟（注意：DNA样品从负极向正极泳动）。
（4）结果观察与分析：关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察DNA 的迁移位置，分析实验结果。
（5）注意事项：
①酶切时，应尽量减少反应中的加水量，以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。
②进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱。
③溴化乙锭是一种强烈的致癌物质，使用时必须戴手套。实验结束后，含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。
