酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（ELISA）因其特异性高，敏感性也好，受到国内外许多学者的认可。细胞免疫随病情加重而减弱，体液免疫随病情加重而增强。结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌，尤其是在巨噬细胞内。有研究认为：对结核菌的免疫，首先是细胞免疫，其次才是体液免疫，二者是分离的。所以，反映细胞免疫强弱的迟发性变态反应，不能检出所有的结核病牛，仅以此法检测牛结核病显然是不准确的。
有研究认为，结核病牛血清抗体IgG与正常水平差异显著，从理论上阐明了检出血清中抗体以诊断疾病的可能性。结核菌的IgG抗体的血清水平与病变程度呈正相关，因此，检测血清中IgG抗体的水平对于疾病的诊断有重要意义。细胞免疫是主要的免疫方式，PPD是检测细胞免疫，血清学方法是检测体液免疫，所以，PPD的检出率要高于血清学方法。但是，PPD阳性不能全部包括所有抗体阳性，且PPD阳性牛，也未必有临床表现，而抗体阳性往往意味着病情正在恶化，正是危险的传染源，所以从这方面来看，血清学方法比PPD检测更重要。另外，非典型分支杆菌感染及某些寄生虫病等非特异性因素的干扰，均可引起牛的迟发性变态反应阳性，而体液免疫的水平却很低，这样就使得血清学方法更容易排除假阳性。但牛分支杆菌与其他许多分支杆菌具有类属的抗原性，因此常出现假阳性反应而干扰牛结核抗体的检测。一些研究人员以鸟分支杆菌作为吸收抗原处理待检血清，吸收其中的非特异性类属抗体，提高了牛结核ELISA的特异性。
还有用ELISA方法对牛结核病血清抗体检测的最佳条件（包括抗原的种类、浓度、纯度、血清稀释度、是否包板等）进行研究探讨，认为ELISA方法是对目前常用的PPD方法的一个补充，因为，ELISA方法可对大型养殖场进行结核病的初筛省去大量的时间和财力、物力的耗费；有人发现传统PPD皮内变态反应存在非特异性的干扰，易出现假阳性，用ELISA方法可排除非典型分枝杆菌造成的非特异性干扰；将ELISA方法同传统的PPD方法进行比较，发现二者有一定的差异，即PPD阳性牛、可疑牛用ELISA方法检测未必是阳性，且ELISA方法有较好的特异性；1972年Eagrall等发现了机体对结核分枝杆菌的免疫机理，认为机体先是有细胞免疫，其次是体液免疫，二者是分离的。细胞免疫随机体抵抗力增强而增强，体液免疫随机体抵抗力减弱而增强；PPD是检测细胞免疫，ELISA是检测体液免疫，所以PPD的检出率高于ELISA的检出率，但PPD不能包全所有ELISA阳性牛，且PPD阳性牛，临床也未必有表现，而ELISA阳性则意味着病情正在恶化，正是危险的传染源，所以ELISA方法从这一点上说比PPD要重要。另外，用SPA-ELISA及BA-Dot-ELISA对牛乳清抗体进行检测，因结核病可通过乳制品传染给人和其他动物，因此，测定奶制品是否存在结核病感染，是一个值得研究的方法。有研究者用BA-Dot-ELISA方法对牛血清抗体进行检测，比较方便、快速。目前，有学者认为牛结核病检测应将PPD方法同ELISA方法结合起来有助于牛结核病检疫，排除非特异性干扰。下面介绍一下原理及方法。
一、基本原理
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
二、间接ELISA
1、材料
（1）包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液。
（2）包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性对照血清；待检血清。
（3）ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
2、方法步骤
（1）加抗原包被→4℃过夜，洗涤3次、抛干。
（2）加待检血清→37℃2小时，洗涤3次、抛干。
（3）加酶标抗体→37℃2小时，洗涤3次、抛干。
（4）加底物液 →37℃30分钟，加终止液。
（5）用ELISA检测仪测定OD值，并判定结果。
淋巴细胞转化试验
淋巴细胞转化试验是测定全血样品对结核菌素PPD抗原细胞反应性。但是这种方法需要从全血中分离淋巴细胞，需要在复合物组织培养介质中培养这些细胞3天～5天，需要用放射核酸技术检测细胞增殖水平。因为试验耗时而且前期准备以及试验操作都比较复杂，如需要较长的孵育期和要使用放射性核苷酸，所以，在常规的牛结核病诊断中并不被采用，而仅仅用于野生动物以及动物园动物的检测。简单介绍一下原理。
正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，细胞的代谢和形态可发生一系列变化。主要表现为电荷的改变，细胞内蛋白质和核酸合成增加，及以细胞形态可转化为淋巴母细胞。为此，在体外利用各种刺激剂激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定T淋巴细胞的应答功能。这类方法称为淋巴细胞转化试验，简称淋转试验，在临床上现已作为测定人体细胞免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂原来检测淋巴细胞转化功能，称PHA刺激淋巴细胞转化试验。
一、分类
体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类。
1.非特异抗原刺激物
如从豆类中提取了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）等，通称为促有丝分裂素（mitogen）。
2.特异性抗原刺激物
如结核菌纯化蛋白衍生物（purifeg protein derivative 简称PPD）等。
3.组织抗原和抗血清
如同种白细胞、抗淋巴细胞血清等。
上述各种刺激物中以PHA应用最广，在体外淋巴细胞培养中，可使正常人外周血液中T淋巴细胞几乎均起转化，其所引起的淋巴细胞转化率大大超过特异性抗原的作用。但这种反应与机体是否致敏无关，因此，是属于非特异性的淋转试验。特异性抗原仅能使相应抗原致敏的淋巴细胞发生转化，转化率一般在5%～30%左右，虽然T淋巴细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。因此，根据PHA激活T淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。从而利用PHA刺激淋巴细胞转化试验的一项非常特异性的体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此，一般称为PHA淋巴细胞转化试验。
PHA淋转试验有形态计数法和同位素计数法两种，前者测定转化的淋巴母细胞百分率，后者测定放射性同位素标记的DNA前身掺入细胞合成DNA的量。
形态计数法的优点是不需要特殊设备，便于一般实验室采用，但判读结果主观因素影响较大，而且有相当数量的中等大小的淋巴细胞难于分类。此外，在培养过程中单核细胞相对增大，形成似转化的淋巴细胞，容易造成误计。加上此法的测定效率低，重现性较差，有被同位素掺入法取代的趋向，但要了解被激活淋巴细胞的比例和形态改变，则仍需应用形态观察法。
二、操作方法
1.形态学方法
加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数。
2.3H－胸腺嘧啶核苷掺入法（3H－TdR）
加分裂原共同培养结束前一定时间，加3H标记的胸腺嘧啶核苷，培养后测定摄入细胞内的放射性物质的相对数量，以间接了发转化程度。
形态学方法比较简单易行，不需特殊设备，但重复性和客观性较差；3H掺入法结果客观，准确性好，重复性好，但需要一定设备条件。
γ-干扰素试验
γ-干扰素试验的原理基于血液T淋巴细胞对牛结核菌素PPD的细胞免疫反应。结核菌素PPD抗原递呈到全血组织培养物中的淋巴细胞后，感染牛结核杆菌的细胞就能产生IFN-γ，未感染牛结核杆菌的淋巴细胞不会产生IFN-γ，因此，γ-干扰素的检测与牛结核杆菌感染密切相关。通过基于单克隆抗体的夹心ELISA检测γ-干扰素。
BrcyceM.Buddle等用ESTA-6作抗原进行γ-干扰素试验，并将其与PPD皮内变态反应进行比较，发现用ESTA-6作抗原比PPD变态反应特异性高，敏感性低，但可减少假阳性，还可对PPD变态反应阴性牛进行检测。而且据RyanTJ等报道，结核菌素试验后的8天～28天进行γ-干扰素试验，对其灵敏度和特异性没有显著影响。但是成本也高，并且收集血样后试验必须在8小时内进行。所以，这种方法不适合于临床牛结核病的检测。我国在此方面还没有应用。有报道称：用澳大利亚、美国、爱尔兰、新西兰、意大利和西班牙的13000头牛进行田间试验，结果表明BOVIGAMTM在诊断牛结核病时更敏感，甚至能检出早期感染牛。
在美国国家动物疾病中心的家畜细菌病研究中心（美国爱荷华州Ames），用20头对灭活牛结核分枝杆菌敏感的Hereford食用牛进行了实验室对照研究。比较了BOVIGAMTM对美国PPD和辉瑞澳大利亚PPD的反应，表明不管用美国的PPD还是用澳大利亚的PPD刺激，所有牛都表现为阳性。另外，新西兰的研究表明，试剂盒的特异性不受皮肤试验的影响，在尾根皱襞试验（CFT）后3～30天使用时比颈部皮肤试验（CCT）更加敏感。
此外，还有菌体成分检测法，利用薄层层析技术（thin-layerchromatography，TLC），通过分析牛分支杆菌的脂质成分PGL（pheno licgly colipid）与PDIM（phthiocer oldimy cocerosate），可以快速的检测和鉴定牛分支杆菌，仅需10mg～15mg的细菌培养物即可，具有简便、快速的优点，可以成为传统生化鉴定的替代方法。
当然，牛结核病的诊断方法有很多，无论哪种检测方法都有其优点和缺点，如与细胞免疫相应的淋巴细胞增生试验和γ-干扰素试验或者因为操作繁琐，或者因为成本高，所用试剂含有放射性物质，难以在牛结核病的常规检测中运用；分子生物学检测技术需要贵重的仪器设备，技术复杂，对实验室和操作人员的要求较高等原因，使其在常规牛结核病普查中难以运用；目前作为法定检疫方法，结核菌素试验仍然是普查检疫中运用的方法，但它有许多不足之处。所以，牛结核病普查中比较好的做法是，检测细胞免疫的结核菌素试验和检测血清抗体的间接ELISA同时运用，互相弥补不足之处，尽可能的提高检测的敏感性和特异性。在净化牛场时，ELISA检测为阳性的病牛，不管结核菌素试验是否为阳性，都应该进行扑杀处理；结核菌素试验阳性而ELISA检测阴性的牛，应该重复进行结核菌素试验，再结合其他的检测方法，排除非特异性因素的干扰，以降低经济损失。
