经过斯坦因的积极奔走和不断努力，在英国和印度政府尤其是英国驻印度总督寇松勋爵的大力支持下，斯坦因的计划得到了批准。1899年1月11日，斯坦因给安德鲁斯写信说：“新年前夕，我接到了好消息，内务和财政部已批准我作和阗之旅，后来又听说外交部也已同意与中国当局交涉有关事项，这样计划就算是全妥了。我仍然希望此事尽可能不引人注目，因为某个俄国探险队可能正要前往同一个地方，过早泄露消息也许会促使他们采取行动。”1899年2月2日，斯坦因向他的哥哥厄恩斯特写信透露了消息：“简单说吧，印度和旁遮普政府已批准我去中国突厥斯坦进行‘考古探察’的计划，并预支所需经费和购买文物费用7000卢比——此事现在尚未公开，保密原因是我听说俄国人正计划派一支考察队前往（喀什噶尔东北）阿克苏地区和吐鲁番，同时由于沿和阗河的道路……非常好走，我可不愿意让一个匆忙的宣告把俄国人引入我的工作区域里来。由于和阗被认为是位于‘英国势力范围’之内，因此印度奥林匹亚山上那些先生们才会同意。”
1900年初，英国驻北京的公使应寇松勋爵之请，办好了斯坦因前往中国新疆的护照。5月，斯坦因就收到了护照，护照的译文为：
总理衙门发此照予英国学者斯坦因。
兹据H·B·M·公使克劳德·麦克唐纳爵士奏报，称斯坦因博士拟携仆从若干自印度前往新疆之和阗一带，请发护照云云。
因备此照，由总理各国事务大臣盖印发出。
仰沿途各地官吏随时验核斯坦因博士之护照，并据约予以保护，不得稍有留难。
本护照事毕交回，遗失无效。
至此，斯坦因完成了一切准备工作，开始了第一次中亚探险。
斯坦因的第一次考察开始是1900年5月，“5月31日清晨，16匹马驮着我们的帐篷、日用品和器材等，已经整装待发。这些东西似乎太多了，过去我在克什米尔及其周围旅行时，已经习惯于轻装行动了。不过聊以自慰的是，我个人的行李仅仅只占了这个大累赘的一小部分”。经过一个多月的长途跋涉后，斯坦因考察团到达了塔什库尔干，从这里可以到达塔克拉玛干北缘的喀什噶尔和南缘的和阗。在塔什库尔干得到消息，北京爆发了义和团运动，但他们认为，义和团运动不可能传到偏远的新疆，所以斯坦因并没有因此而改变计划。他们于7月10日离开塔什库尔干，向喀什噶尔进发。经过半个月的旅行，于7月30日到达喀什噶尔，马继业夫妇正在那里等着斯坦因。
说到马继业，却是一个很奇特的人。他1867年生于南京，父亲马格里为苏格兰人，曾随英军侵华，参加过第二次鸦片战争，后来协助李鸿章镇压上海、昆山、苏州等地的太平天国运动。据说马继业的母亲是马格里俘获的太平天国某位亲王的公主。10岁以前，他一直生活在南京，后来因他父亲被中国任命为驻英国公使馆的秘书兼翻译，他便随父亲到了伦敦。1887年，他与斯坦因同年到了印度，想在中国领事馆谋个职位，但未能如愿，仅仅被任命为孟买公署的中文翻译，成为印度政府的低级雇员。对此他非常不满意，一直在寻找机会改变这种生活。1890年，由于一个机缘，他随弗朗西斯·扬哈斯本的中文翻译来到喀什噶尔，并在这里生活了28年。喀什噶尔虽与南京不同，但毕竟是中国西部的一个地区，对他来说仍有回到故乡的感觉。而他又是作为英国的代表任职于喀什噶尔，是在为他父亲的祖国服务。因此对于马继业来说，在喀什噶尔任职，可以照顾到父母双方，当然，这只是他心理上的一种平衡罢了。
从1890年开始，马继业便以英国政治代表的身份常驻喀什（即喀什噶尔）。当然，从法理上说，直到1908年清政府才正式承认英国驻喀什领事馆，但英国领事馆的职能实际上自马继业到喀什后就开始了。他在1890年至1908年间的官衔是“驻克什米尔负责中国事务的特别代表”；1908年回英国度假时才被正式任命为英国驻喀什领事；1911年提升为英国驻喀什总领事，直到1918年退休。
马继业在喀什任职期间收集了大批西域古物，主要来自和阗、策勒和莎车的塔克拉玛干觅宝人吐尔迪、毛拉和卓、伊不拉辛以及伪造文物的商贩伊斯兰阿洪。马继业把收购的中亚文物全部送到印度，收人英国梵学家霍恩雷主管的加尔各答孟加拉亚洲学会收藏室，形成了所谓“霍恩雷收集品”。
霍恩雷收集品大部分被运回英国，入藏大英博物馆、印度事务部图书馆、英国皇家亚洲协会图书馆和牛津大学包德雷图书馆。斯坦因将伊斯兰阿洪的造假阴谋揭露后，马继业收藏的90件假文书便被撤出大英博物馆东方写本与印本部，装入两只贴有中亚赝品标签的木箱，扔到一个地下室。1979年，扔在大英博物馆地下室的两箱假文书被人发现，编目后全部转交给了大英图书馆。目前这批假文书仍被扔在图书馆的一个角落里。
斯坦因在喀什噶尔度过了盛夏的两个月时间。在这里，他请道台“向和阗按办发出明确指示”，要他提供必要的帮助，以保证运输、供应、劳工以及行动、发掘、考察的自由。当一切准备就绪后，他便于9月11日告别了马继业，途经叶尔羌向和阗进发。
斯坦因第一次考察的目的之一，便是探明用未知文字书写的“古书”的真相，因此，在到达和阗的前一站——皮山，就开始了古文物的调查。自1895年以来，这些奇异的“古书”就已开始在西方被收藏，而来源则主要是和阗的“寻宝人”伊斯兰阿洪。伊斯兰阿洪说他的“古书”大多是在皮山、和阗之间沙漠中的古代遗址中发现的，其中有个喀拉库尔麻扎即黑湖墓葬群。斯坦因在这里进行了初步考察，但一无所获，接着就进入了和阗。在和阗，斯坦因还是想澄清那些可疑文字的真相。他虽然没有亲自找到“古书”，但在和阗，寻宝已是当地的时尚，尤其是穷人们，更将其作为发财致富的一条途径。有一天，一个俄国亚美尼亚人带来一本古书：残剩的10页桦树皮纸，写着不认识的文字。在《沙埋和阗废墟记》中，斯坦因写道：“我一眼就看出桦树皮树页未经我在克什米尔所见古代桦树皮文书全都做过的那种处理，伪造者也没想制造在桦树皮上写字需要的那种特殊墨水。因此当我做‘水洗试验’时，只要一个湿指头就可以抹去那些奇异的‘未识文字’。”这个伪造的古书与加尔各答霍恩雷藏品中的一些木板印刷品极其相似。随后在一次偶然的交谈中，斯坦因得知，将抄本卖给亚美尼亚人的“卖主”与伊斯兰阿洪有关，这更加深了斯坦因对古书的怀疑。
在和阗，斯坦因还仔细研究了巴得奥迪汗派遣寻宝人找回的资料，并见到了富有经验的寻宝人吐尔迪。吐尔迪曾带回一些上面写有印度婆罗谜文字的壁画，还有佛像浮雕的残片以及一些用中亚婆罗谜草体写成的纸文书残片。正是吐尔迪带回的样品，曾引起了斯文·赫定对塔克拉玛千古代城市的考察。为了确定斯文·赫定当年所“发现”的遗址是否即为丹丹乌里克，斯坦因便于12月7日向沙漠中的丹丹乌里克进发了。
位于和阗以北沙漠96公里处的丹丹乌里克遗址，有一座小建筑群。在一些残墙上，还保留着一些佛像和菩萨像。通过这些壁画的特殊形式，斯坦因估计，这些寺院与居地的放弃毁坏，是在伊斯兰教传人之前的最后数世纪。同时他还在遗址中捡到一些有“开元”年号的中国铜币。在挖掘其建筑时，发现了几页用婆罗谜文字书写的佛经，接着又发现了更多的文书。根据古文字学的知识，可以知道这些文书的年代在公元7世纪以前。同时还发现了一些汉文文书，其中有一件文书的年代相当于公元780年。
1901年1月2日，斯坦因便写了一封短笺给印度政府：“在沙漠里这个古遗址度过的最后数周中，古代梵文、突厥文和汉文手抄本的出土以及佛教壁画方面取得有趣的成果。它们都是从沙漠遗址中清理出来的。”他没有时间对其收获物进行全面研究，就又向另一个目的地——尼雅进发了。
在尼雅，斯坦因偶然见到了两块佉卢文木牍。这使他非常惊奇，因为当时怯卢文虽已在中亚发现，但只是在早期的于阗钱币上，惟一的一份桦树皮抄本为法国旅行家杜特依兰于1892年所获。所以斯坦因就急忙前往发现木牍的地方，并对其进行了清理，结果发现了100多枚木牍。从其用途和外表特征估计，似乎是一些信件，但其数量则与此之前印度国内外保存的所有用于研究的佉卢文资料的总数相等。随后又在另一建筑物中发现了60枚木牍，其内容大都是备忘录、帐簿及便笺之类。
尼雅遗址规模宏大，无疑是某个古代城市所在地。但它究竟是中国史籍中提到的哪座古城呢？经中外学者的考察研究，可以断定它就是汉代西域36国中的精绝国所在地。
尼雅遗址主要由佛教寺院、官署、住宅群、种植园、冶铁作坊等古代建筑组成。遗址中心有一座巨大的佛塔，由此可见佛教在这里具有特殊的地位。从尼雅遗址内的建筑物装饰和家具纹样可以看出，它明显受犍陀罗佛教艺术的影响，这和遗址内发现的许多佉卢文犍陀罗语文书是一致的。另外，尼雅遗址中还有相当数量的汉文木简残纸，其中一件记有西晋泰始五年年号，斯坦因把尼雅遗址的年代定在公元3世纪就是根据这件材料。
尼雅遗址的发掘，在考古学上具有重大的意义，它可以与西欧的庞培古城相媲美。公元79年，意大利的维苏威火山突然爆发，罗马帝国的庞培城被火山灰湮没。1754年，当考古学家重新发现这座罗马古城时，城内的宗教场所、街道、商店等建筑设施仍然保持着1700年前的原貌。1901年，当斯坦因闯入尼雅遗址时，流沙之下的佛寺、庄园、葡萄园等古迹也是1400多年前的原样，因而被誉为“中亚庞培”。
在和阗期间，斯坦因还查清了过去那些“古书”的真伪。在斯坦因掌握的为数众多的怯卢文、印度文、于阗文（中亚婆罗谜文）、藏文和汉文抄本中，没有一种是“未知文字”，更进一步讲，就是在皮山之类地方根本没有见到据说曾出土过那种文书。1895年至1899年间以印度政府名义购买的许多抄本可能都与和阗寻宝人伊斯兰阿洪有关。
伊斯兰阿洪在当地也算是一位有知识有心计的人，作为一个小商人，专门从和阗乡村收集古钱币、印章等古物。在与阿富汗商人交易时他得知，印度人十分珍视抄本，即便是从丹丹乌里克发现的小纸片也很贵重。商人的冒险性和获利性使他对此十分感兴趣，但又不愿从事艰辛的寻宝生活，便开始了“制作”抄本的冒险活动。刚开始时，他还企图仿制真正的抄本，傅艮快就意识到，无论真假，反正那些欧洲的主顾们都看不懂，因此并不值得辛辛苦苦地仿制。当他卖出所有的仿制品时，又建立了一所作坊专门从事“未知文字”的制作，以满足日益增长的市场需求。但在当时世界的寻宝热中，这种随意书写的速度还是显得太慢、太累赘，因此他又将注意力转移到“木板”上，即用“木板”印刷。其工序是首先将纸染一下，使它看起来很脏。印刷之后，将纸放到壁炉中用烟熏，使人有一种很古的感觉。然后胡乱模仿欧洲书籍的装订法将其装订。最后他们就在抄本上洒些沙子，以证明埋藏了很长时间。
斯坦因详细了解了伊斯兰阿洪的造假情况后，断定这种造假营生是很赚钱的，因为在霍恩雷的《报告》中就叙述、注释了大约45件大尺寸的木板印刷品。他想：如果伊斯兰阿洪知道，他“制作”的许多假文书被用细软的摩洛哥皮革包装，放在大图书馆，甚至在大英博物馆抄本部中，他将会多么自豪。
斯坦因回到伦敦后，专门拜访了霍恩雷。斯坦因与霍恩雷都是学者，在探求古物和追求学术真理方面有许多共同之处。当斯坦因向霍恩雷说明伊斯兰阿洪伪造文书一事后，霍恩雷非常失望，但他对斯坦因带来的写本十分感兴趣。作为一名有声望的印度学家，霍恩雷因解读伪造的文书而浪费了大量时间，为此他心中很懊恼。但当斯坦因给他带来大量用未知文字写成的真文书时，他的心理才得到平衡，并重新开始解读，给久已失传的古于阗语以生命，他最终断定，这是用印度字母书写的一种古伊朗语。
在中亚及新疆发现的古文字，情况比较复杂。佉卢文大概产生于古波斯帝国统治中亚时期（约公元前5世纪），但是目前还没有发现属于这个时期的佉卢文。现在所知最早的是公元前3世纪印度孔雀王朝的阿育王在古代犍陀罗（今巴基斯坦白沙瓦）用佉卢文颁布的摩崖法敕。中亚贵霜王朝（约公元1世纪前后）也把这种文字当作官方文字。公元2世纪以后，随着中亚贵霜帝国的灭亡，佉卢文也逐渐在中亚绝迹，并被另一种印度古文字——婆罗谜文所取代。值得注意的是，这种在印度和中亚废弃的佉卢文古文字，直到公元3世纪至4世纪，仍然在中国新疆地区，尤其是楼兰作为官方文字使用。
从语言体系而言，佉卢文原来用于拼写犍陀罗语。而在新疆地区的考古发掘及研究证明，犍陀罗语原来只是楼兰人的宗教和官方行政用语，不是楼兰人的本族语言。就像英语只是印度人的官方语言而不是印度本族语一样。楼兰本族人使用的是“吐火罗语”。
被视为“欧洲甲骨文”的吐火罗语，是本世纪初在塔里木盆地发现的另一种中亚死文字。在库车、焉耆、吐鲁番等地都发现了一些吐火罗语文献。在敦煌藏经洞遗书中也有不少用吐火罗语书写的宗教、文学和医药文献。
犹如汉语在不同地区有不同的方言一样，吐火罗语也由于使用的地区不同而有不同的方言。如在新疆地区发现的吐火罗语写本的语言就不完全一样，研究者将其区分为A和B两种方言，A方言主要流行于焉耆和吐鲁番，B方言主要流行于库车。
